食品中残留物定性首选色谱-质谱联用技术

  新的《中华人民共和国食品安全法》(以下简称《食安法》)已于2015年10月1日正式实施了。

  有专家说,新《食安法》是我国为食品安全制定的最严格的一部法律。《食安法》第三条明确指出:“食品安全工作实行预防为主、风险管理、全程控制、社会共治,建立科学、严格的监督管理制度。”《食 安法》中列明了影响食品安全的项目,包括这样一些内容:致病性微生物、农药残留、兽药残留、生物毒素、重金属等污染物质以及其他危害人体健康的物质。这些物质的甄别要靠“按照国家有关认证认可规定取得资质认定”的食品检测实验室检测(《食安法》第八十四条)。第八十五条中又规定“食品检验由食品检验机构指定的检验人独立进行。检验人应当依照有关法律、法规的规定,并按照食品安全标准和检验规范对食品进行检验,尊重科学,恪守职业道德,保证出具的检验数据和结论客观、公正,……”。保证检验数据客观、公正,用分析方法学解释就是数据准确。当前国家规定食品中需要检测的有机有害物质约600种,它包括:残留农药、残留兽药、食品添加剂(包括GB 2760以外的非法添加物)、环境污染物、生物毒素(因为许多生物毒素,如黄曲霉毒素等,检测方法与有机有害物质相同,通常也遵照有机物分析结果的判定方法执行)等,对于上述被测物质分析结果数据准确是指定性和定量准确。

  怎样的数据算是准确呢?下面以残留农药分析为例,通过对其分析检测的发展历史,来了解色谱-质谱联用技术在当今食品卫生项目检测中具有的重要地位。

  二十世纪四十年代滴滴涕农药问世,化学农药开始大量使用。

  六十年代欧洲等国发现,有机氯农药难以降解而污染环境,并通过残留在农产品中进入人类的食物链,对人类健康产生不良影响,提出了农药残留概念,开始了对食品(这里的食品是大食品概念,包括初级农产品和加工食品)中残留农药的分析检测。

  八十年代我国改革开放初期,向发达国家出口的食品是当时主要换取外汇的商品之一。为了满足国外对食品中农残限量的要求,当时的进出口商品检验局开始检测农残,主要项目是六六六和滴滴涕。六六六和滴滴涕都是含氯农药,各有四个空间异构体,检测时加上内标物环氧七氯,共检测9个物质。分析采用气相色谱-电子俘获检测器(GC-ECD)检测,色谱柱采用填充柱。由于色谱法定性是靠保留时间,只有2M长的填充柱要想获得对被测物良好的分离效果,需选择特定担体和不同配比固定液。那时每一个方法检测的农药多为一种或一组几个性质相似的农药,色谱柱是专用的,前处理也具有很强的针对性,否则在实际检测时,加上基质干扰,就可能影响定性、定量结果。

  九十年代,弹性石英毛细管色谱柱商品化,这个技术大大提高了色谱柱的分离能力和峰容量,使一个方法一次检测农药的数量增加到了30多个,而且对化合物分析的适用性更广了。但利用色谱保留时间定性,对于基质复杂样品中农残定性仍然是一个难题,而且检测的农药种类多了,前处理操作更加复杂,耗时更长,否则很难同时达到方法学规定的回收率和重现性。当时绝大多数实验室还没有财力配置色谱-质谱联用仪,所以推出了一个双柱定性方法,即:不同化合物在不同固定相上的保留时间大多数情况下是不一样的,利用这一原理,如果怀疑是阳性检出,再用另一根不同极性的毛细管色谱柱再检测一遍,如果这时被测物的保留时间仍然与农药标准品一样,就视为检出。这种方法不仅麻烦,而且定性还是只有保留时间而没有化合物的分子信息。

  九十年代中期,毛细管气相色谱与小型台式四极杆质谱仪联用技术逐渐成熟,商品仪器价格不断降低,越来越多的食品实验室开始配备气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)。当时发达国家对食品中要求检测的农残项目也增加到200多种。这么多需要检测的项目,再靠传统的色谱法一个一个或几个几个农药的检测已经无法满足对食品卫生项目的监控要求了。为应对检验新需求,欧盟公共卫生实验室(荷兰)推出了第一个利用GC-MS技术检测食品中130多种残留农药方法,改变了传统农药残留检测模式,即:先采用 GC-MS对样品进行筛查式检测,当发现疑似检出农药时,再用针对性的分析方法对可疑物进一步定性确证和定量。在世界粮农组织/世界卫生组织(FAO /WHO)《食品法典》2000版(CODEX ALIMENTARIUS COMMISSION, PESTICIDE RESIDUES IN FOOD, Methods of analysis and sampling, second edition, 2000)中列明需检测的残留农药为197项。同时,法典首次规定了对检出的农药要用MS进行定性,并对GC-MS定性做了详细的规定,即:首先考虑用MS的全扫描(Full scan)方式检测,对比被测物与标准品二者的质谱图是否一致。当全扫描检测灵敏度达不到限量要求时,可采用选择离子(SIM)方式检测,SIM方式定性必须同时满足三个条件:第一,被测农药的保留时间值与对应标准品的保留时间值一致;第二,所选择的多个特征离子必须同时存在;第三,所选离子间的丰度比与浓度相近的对应标准品一致。质谱给出的是化合物的分子信息,所以比只有保留时间的色谱定性能力有了本质飞跃。由于色谱-质谱联用技术检测能够同时得到化合物多个信息而有更好的定性能力,对样品前处理的要求也降低了,从而使整个分析的效率提高了。

  在质谱、核磁、红外三大定性谱中,质谱的检测灵敏度最高,响应速度最快,能与毛细管气相色谱仪和超高效液相色谱仪很好的匹配。随着现代质谱仪器性能的不断提高,各种质谱组合增强功能的推出和整体价格的不断降低,应用色谱-质谱技术对食品中残留物分析所表现出来的优势是其它任何技术所不具备的,色谱-质谱技术已经成为食品中残留物分析最重要的技术手段,不是之一!欧盟在为动物源食品中残留兽药和食品中残留农药监控计划推出的《执行关于96/23/EC指令分析方法程序和结果解释的欧盟委员会2002 /657/EC指令》、《食品和饲料中农药残留分析质量控制和验证程序SANCO/12571/ 2013指令》,对色谱-质谱定性、定量制定了详细的方法学技术规范,成为当前做食品中残留物分析实验室管理和检测人员必念的“经”。我国也以国际上先进的技术标准和指令为依据,结合我国国情,制定了《GB/T 27404—2008,实验室质量控制规范 食品理化部分》标准,为分析检测程序和结果判定提供了技术依据。我国现在有《GB 2763—2014,食品中农药残留最大限量》、《GB 2760—2014,食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》和《农业部公告禁用兽药目录》等标准和法规,对食品卫生指标都有严格规定,违反这些规定就是违法,按照新《食安法》对违反该法律规定 的行为要进行相应处罚,直至追究直接负责的主管人员和其他直接责任人员的法律责任。所以说,实验室提供的检测数据具有法律效力,数据必须准确无误,避免因 数据的错误而冤枉了一个好人,毁了一个企业。

  前面提到的指令和标准有很完善科学的方法学理论作为技术支撑,严格按照标准程序操作和方法 学规定计算得到的检测结果,无论是在国内,还是国际都是被认可和接受的。本文结合指令和标准中的规定,就实际应用色谱-质谱联用技术检测食品中残留物定性 时应注意的一些问题和检测结果数据判定的典型步骤归纳如下。

一、定性分析需要满足的最基本条件

  食品中残留物分析多为目标化合物检测,出具的最终结果报告包括定性和定量内容,因此实验前都要找到对应的标准物质,特别是用液相色谱-四极杆串联质谱 (LC-MS/MS)分析,要用标准品对仪器参数进行优化。对检测结果首先要定性准确,接下来定量分析才有意义。什么样的定性分析结果是可以接受的呢?根 据上述两个欧盟指令和国标的规定,要认真选择和预设相关参数,核对这样一些最基本数据:

  1.色谱的保留时间。前文中虽提 到单一的色谱保留时间值定性是不准确的,但在色谱-质谱联用时仍然可以作为一个重要的定性参数。被测物与对应标准品之间保留时间允许偏差,在 2002/657/EC中规定GC的允差为 ±0.5%,LC的允差为 ±2.5%,在SANCO/12571/2013中规定的允差为 ±0.2min。在比对保留时间时有一个问题要注意,就是不同基质可能对保留时间会有影响。当被测物与对应标准品之间保留时间偏差在允差附近时,要考虑一 下是不是因为基质不同而影响到保留时间时超出允差。可以用两种方法进一步确定一下:一是用相同基质的空白提取液配置标准品液,二是在被测样品液中添加标准 液。

  2.当质谱全扫描检测模式的灵敏度能满足检测限量要求时,应该首选全扫描模式检测,这时可以得到被测化合物完整的分子信息。在 全扫描模式检测时,要注意这样几个问题:一是标准品与被测物进行质谱图的比对时,条件越接近越好,如,基质相同,浓度相近;二是要仔细扣除背景光谱,无论 是手动或自动,通过反褶积(去卷积)或其他算法,确保所得到色谱峰的质谱图是典型的。当使用背景校正时,必须在批处理中统一地应用一种方法;三是在做目标 化合物检测时,合理选择扫描的质量范围,一般低端从 m/z 50开始,但若有小于 m/z 100的离子非常强,且不是很重要时,可以从 m/z 100开始,高端到化合物分子量 + m/z 20(或50)。

  3.当全扫描检测模式的灵敏度无法满足检测限量要求时,可以采用选择离子模式(SIM)、反应监测模式(SRM)或多反应监测模式(MRM)检测。农兽药残留分析基本上都是采用这几种检测模式。通常SIM、SRM、MRM检测模式比全扫描模式的检测灵敏度高约2个数量级以上。

  4.采用SIM、SRM或MRM定性检测时要同时满足三个条件:

  (1)被测物质与对应标准的所有选择离子色谱图有相同RT值;

  (2)分析中所有选择离子应在相同RT时间窗口同时出现;

  (3)被测物质与对应标准(最好与被测物浓度和基质相近)的选择离子之间有相同峰度比。

  5.残留兽药被测物离子选择的规定:禁用兽药识别点数≥4;限用兽药识别点数≥3。这一规定可以扩展对所有食品中残留有害物检测。2002/657/EC中常见MS技术离子类型与识别点数的关系见下表:

MS技术每种离子的识别点
低分辨质谱(LRMS)1.0
LR-MSn前体离子1.0
LR-MSn产物离子1.5
高分辨质谱(HRMS)2.0
HR-MSn前体离子2.0
HR-MSn产物离子2.5

  6.SANCO/12571/2013中规定用GC-MS-SIM检测农药残留,最低要求是:当 m/z > 200时,至少选择2个离子;当 m/z > 100时,至少选择3个离子。这个规定一般在多残留(100种以上农药)初筛时采用,最终定性还需再增加选择离子个数或采用不同的色谱技术。

  7.鉴定依赖于诊断(特征)离子的正确选择。分子离子和准分子离子([M+H]+,[M-H]-)是重要的诊断离子,只要有可能应包括在检测和识别过程 中。在一般情况下,特别是对于单级质谱,应选择质荷比值相对高的离子(如,至少 m/z > 100)。只是由于失去水或失去相同集团所产生的离子,即使有较高 m/z值也很少选用。特征同位素离子,如:多氯或溴同位素簇群,对定性鉴别很有帮助,但所选的诊断离子不应该全部来自同一个前体离子分子,必须再选择来自 其它裂解得到的产物离子。最终诊断离子选择取决于整个分析过程可能带来的背景干扰。一个检测方法的检出限取决于所有选择离子中信噪比最低的离子。所以,通 常实验初期可以考虑多选几个诊断离子,在实际检测时发现某个诊断离子受到背景干扰时,将其去掉。

二、对疑似阳性结果的进一步分析

  严格遵照前节定性分析规则出具的检测结果一般没有问题了。但是,有些食品的基质很复杂,比如中药、茶叶,这些样品要是做多种农药残留的检测,其本身就有 非常多与农药分子量和结构接近的化合物,当采用低分辨的GC-MS-SIM仅选择2、3个特征离子检测时,会有很多来自基质的干扰物质。再比如动物源食品 中检测禁用兽药,其执行的最低要求执行限(MRPL)基本上都是小于1µg/kg,目前检出限要求最低的是日本肯定列表规定的肉及肉制品中盐酸克伦特罗 (瘦肉精),其检出限为0.05 µg/kg,对于加工后的动物源食品,如:罐头、香肠、烤串等又添加了许多调味料,这么复杂的体系却又是如此低的检出限,也常常会有来自基质或分析系统的 干扰物质。为了更准确定性,也是对出具结果的负责,往往需要再做进一步的确证。随着质谱技术的发展,现在有多种技术手段可以对疑似阳性结果做进一步分析, 简单的说,就是要提高确证的识别点数。目前常采用的方法有这样一些:

  1.高分辨质谱法。根据欧盟指令规定,高分辨质谱的 分辨率必须≥10000。从前表可以看出,高分辨质谱离子的识别点数较之低分辨质谱要高,若选择同样的离子数,高分辨质谱的识别点数更高。过去GC可以与 磁质谱仪联用,但是LC没有与之较好匹配的质谱,满足不了残留兽药分析。近年赛默飞(ThermoFisher)公司推出了四极杆/静电场高分辨质谱仪 (Q Exactive,简称QE),可以与LC联用(也可以与GC联用)。LC-QE已经可以满足最严苛残留兽药限量的检测。(可参见我的博客《对高分辨质谱Q Exactive的性能测试及在食品中残留物分析的应用》)。 同样是选择1个前体离子和2个产物离子,三重四极质谱(QqQ)的识别点数为4(1+1.5×2),而四极-高分辨质谱的识别点数为 7(2+2.5×2)。近几年TOF-MS的检测灵敏度也有不少提高,可以用于添加剂、农残等项目的检测,但做禁用兽药检测灵敏度还显不够。

  2.前体离子二级全谱法。QqQ 检测时采用MRM扫描方式也是受到检出限限制无奈的选择。如果选择前体离子碰撞后产生的二级质谱全谱定性,这时的检测灵敏度根本无法满足残留兽药检出限量 要求。而通常选择2个产物离子,灵敏度虽然提高了,但被测物分子信息却丢了很多。Sciex公司推出了四极杆-线性离子阱质谱(QTrap),利用离子增 强功能(EPI),使二级质谱全谱的响应强度提高2个数量级以上,完整保留了被测物的分子信息,定性准确度大大提高。

  3.多级离子解析法。如 果二级产物离子比较强,还可以再进行一次碰撞,以三级产物离子作为最终判定离子。三级的2个特征产物离子和离子比都相同,而且还有相同的保留时间,其概率 非常低了。这时定性的识别点数至少是5.5(1+1.5+1.5×2)。现在有这种检测功能的常用仪器有:Sciex公司的QTrap系列。另外,赛默飞 公司的线性离子阱-静电场高分辨质谱(LTQ-Orbitrap)和岛津公司的离子阱-飞行时间质谱(IT-TOF),不仅可以做多级,而且还是高分辨质 谱仪,不仅可以定分子量,还可以定结构,定性更加准确。但多级离子检测时,每增加一次解离灵敏度都会有一定下降,所以,比较适合做含量相对高的添加剂、农 残等项目检测,不太适合做禁用残留兽药的检测。

   总之,近年来国家对食品检测实验室投入了不少资金,现在食品检测实验室的硬件较之从前都有大幅提高,GC-MS和LC-MS/MS基本都已经是标配。今后再购置仪器时,应根据实验室的主要工作合理配置仪器,使实验室出具的数据更加可靠、准确。

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