质谱成像技术应用于成年果蝇大脑中 GABA的可视化分析

黑腹果蝇（以下简称果蝇）是一种被广泛应用于生物学各个领域的模型动物。作为一种模型动物，果蝇有很多优点，比如，它的生命周期短，只有10天左右，它的基因重组技术已得到确定，培育和创建新模型的成本不高，而且从动物伦理学角度来看，不存在任何问题。由于研究人员已经掌握与果蝇相关的遗传知识和基因重组技术，因此可将其广泛用作模型生物，用于研究阿尔茨海默症、帕金森病和肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)等神经退行性疾病(1)。

神经递质在神经退行性疾病中扮演重要角色。举例来说，众所周知，γ-氨基丁酸(GABA)作为一种抑制性神经递质，对各种生物行为和神经退行性疾病都产生影响(2)。

为了确定GABA在大脑中的功能，不仅需要研究大脑中的GABA浓度，还需要研究其空间定位。因此，我们认为了解GABA在果蝇头部的位置信息，对于理解GABA在各种疾病模型中所起的作用至关重要。

虽然研究人员已采用免疫组织化学染色和荧光标记成像技术来研究GABA在果蝇头部的空间定位信息，但这些传统方法主要通过观察GABA合成酶GAD1(3)或GABA转运体(4)而间接分析GABA的分布。因此，近年来基质辅助激光解吸/电离质谱成像(MALDI-MSI)法，作为一种直接检测目标分子的技术，在非哺乳动物模型生物体生物分子的可视化分析中备受关注。

图1显示了MALDI-MSI的工作流程。使用此方法时，首先对样品材料进行切片，通过激光照射，用离子化辅助剂（基质）对样品切片中的分子进行解吸和电离，然后用质谱检测这些分子。在组织上连续进行激光照射，得到的系列解吸/电离后的离子并进行质谱检测，并通过提取质谱图中m/z强度信息并结合位置信息，获取显示分子空间分布的二维图像。由于MALDI-MSI通常不需要荧光标记或其他可视化标签，且分子本身离子化后可被质谱检测，因此该项技术被认为对直接观察成年果蝇头部的GABA有所帮助。在以前的研究中，其他研究小组通过使用MALDI-MSI 成功实现对小鼠大脑中的GABA进行可视化分析(5)。

然而，到目前为止，MALDI-MSI应用于成年果蝇头部GABA可视化分析还存在一些困难。首先，对于通过福尔马林固定法和石蜡包埋法(FFPE)等方法固定的样本，进行MALDI-MSI分析很困难，因为GABA等小分子代谢物在脱蜡过程中容易被冲洗掉。而且，由于果蝇头部非常小(≤1mm3)，很难制备MALDI-MSI分析中常用的冷冻切片(6)。除了样本大小问题之外，果蝇头部还覆盖有坚硬的角质层。这些坚硬的角质层中的脑细胞没有中间丝，而且由于这些脑细胞相对于哺乳动物的脑细胞更加柔软，因此，果蝇头部和大脑的硬度有很大的差异。

基于以上特征，在保持成年果蝇头部形态的同时制备其切片非常困难。Cryo-tape冷冻切片胶带(Leica)通常被用于制备这类样本的切片。然而，市售冷冻切片胶带包含一层非导电膜，放置在此类材料支撑介质上样品，其表面的离子强度会被极大降低。造成这种现象的原因被认为是由于绝缘体的存在和样品板上的电场扰动，导致样品表面带电所引起。

此外，MALDI方法对GABA的离子化效率很低，且果蝇头部的GABA含量相对比哺乳动物少，这通过它们脑部相对大小的差异便可想象。这也是直接可视化分析果蝇大脑中GABA分布的难点。因此，即使可以对啮齿类动物大脑中的GABA进行直接离子化和MALDI-MSI分析，仍不清楚是否可以在果蝇头部检测到GABA。

本应用报告介绍了我们小组之前发表的可视化分析果蝇脑部GABA空间分布的内容(7)。我们研究了解决上述果蝇脑部切片制备难题的方法并直接获取组织切片，优化了原位组织衍生化方法以提高GABA的离子化效率。此外，本文还概述了当前原位组织衍生化方法，包括其显著特点。

1.样品制备方法

1.1制备切片

用镊子分割果蝇头部，立即将其浸入70%乙醇中。然后，将其头部置于填充有4%羧甲基纤维素(4%CMC)的一次性模具（base mold，As One Corp.）中进行包埋。包埋后，将模具包裹在铝箔中，用液氮快速冷冻。将冷冻样本在-20℃下放置1小时，然后使用冷冻切片机(CM1950, Leica)将样本切成15μm的薄片。分别将冷冻箱和样品头的温度设置为-18℃和-16℃。

我们研究了两种切片方法，一种方法使用Cryofilm，另一种使用防卷板Anti-roll bar（图2）。将通过这两种方法制备的切片放置在带有氧化铟锡透明导电层的玻璃载玻片(ITO，Matsunami Glass)上，并使用恒温器在40℃的条件下干燥5分钟。使用双面导电胶带(3M)将Cryofilm获取的切片固定于ITO玻璃载玻片上。

1.2原位组织衍生化

衍生化试剂采用2,4-二苯基吡喃四氟硼酸盐(DPP-TFB)(8)，并且为了将GABA 与其结构异构体区分开来，也采用了4-羟基-3-甲氧基肉桂酸(CA)(9)。DPP-TFB储备液使用甲醇溶液调整至10mg/mL，储存在-30℃备用。使用600μL超纯水、900μL甲醇和1μL三乙胺的混合液作为溶剂配制DPP-TFB溶液，并将它与储备液混合达到69:6的比例。DPP-TFB 溶液使用喷枪(Procon BOY PS270, Creos)进行雾化。进行喷雾时，在喷嘴与组织表面之间保持375px的距离。

在每个切片上用50μL溶液。进行喷雾后，将样品在填充了50%甲醇蒸汽的腔室内放置60分钟，以加快衍生化反应。进行衍生化后，在每个切片上喷上20μL的10%乙酸以酸化组织。

CA溶液以甲醇为溶剂，由11.5mg/mL的CA和4.25mg/mL的反式阿魏酸（trans-FA）制备而成(9)。与DPP溶液一样，CA溶液也需用喷枪喷雾。喷雾后，将样品在室温下放置10分钟，以进行衍生化反应。

1.3用于DPP-GABA检测的基质涂敷

通过MALDI-MSI方法观察微小样品（例如果蝇头部）中含有的生物分子时，基质涂敷方法极为重要，因为组织上基质晶体的聚集体会产生干扰。为了解决此问题，我们采用了两步基质涂敷法：第一步是使用 iMLayer™（图3）进行基质升华，第二步是对基质溶液进行喷雾(10)。衍生化反应后的样品，使用iMLayer 进行升华，在组织表面沉积厚度为0.5μm的α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)。在升华期间，含有基质粉末的基质盒的温度设置为250℃。使用iMLayer进行升华后，在第二步中，用喷枪在每个切片上喷涂50μL的CHCA溶液。使用0.1%甲酸和60%超纯水、30%乙腈和10% 2-丙醇的混合物作为溶剂，将CHCA溶液的浓度调整为10mg/mL。

1.4MSI 分析条件

MALDI-MSI分析使用了iMScope TRIO™（图4）。像本文中描述的微小样本的成像分析中，显微镜观察到的光学图像与MSI的结合是非常重要。iMScope TRIO对于此类应用分析很有效。MALDI使用的激光为Nd: YAG（波长：355nm，频率：1kHz）。激光照射次数设置为200，累计次数设置为1/像素。激光照射直径为1（约10μm），激光强度为25，激光斑点间隔为20μm。样品电压和检测器电压分别为3.5kV和2.1kV。DPP衍生化样品的检测质量范围为m/z 100-330，CA衍生化样本的检测质量范围为m/z 140-270，MS/MS分析在正离子模式下进行。对于DPP-GABA和CA-GABA，前体离子分别设置为 m/z 318.15和m/z 264.12。

2.结果和讨论

2.1切片方法的研究

前面的章节描述了在保持良好形态的同时对成年果蝇头部进行切片的难度，这是因为样本体积小且大脑的硬度和头部的外部结构之间差异较大。进行MSI分析时，在切片过程中维持良好的形态非常重要，这不仅是为了观察检测神经递质，而且还是为了获取有关分子空间定位的准确信息。由于目前尚未报告适合成年果蝇头部低分子量MALDI-MSI分子的切片方法，本文研究了一种适合于MALDI-MSI的切片方法。

对果蝇之类的显微样本进行组织切片时，通常会对样本进行包埋和冷冻。但该方法存在问题，因为果蝇身体上覆盖的硬毛会排斥包埋剂，而且由于样本与包埋剂之间存在间隙，无法进行稳定的切片。因此，我们证实了如下情况，将样本浸入70%乙醇后再包埋4% CMC时，可以使样本表面与包埋剂之间紧密粘合。

研究认为，通过用70%的乙醇润湿表皮角质层，可实现在不排斥包埋剂的情况下包埋样品。为了避免形成冰晶而对组织造成损伤，使用液氮法快速冷冻包埋的样本。然后，再用两种不同的方法对成年果蝇头部进行切片，从而进行比较研究，一种方法使用防卷板，另一种方法使用 Cryofilm。在优化了冷冻箱温度和样本头温度（图5A、B）的前提下，这两种方法均成功获得了形态保持完好的组织切片。尤其是，使用Cryofilm 的方法更容易制备出形态良好的切片，因为薄膜粘在样品上并起到支撑体的作用。然而，从图5C中峰值强度的比较可以看出，在使用Cryofilm获得的样品中，DPP-GABA产生的峰值强度明显较低。

研究认为，造成这种差异的原因是Cryofilm 作为电绝缘体造成充电（如前所述），以及形成的离子进入质量分离部分而引起电场扰动。基于上述结果，我们得出如下结论：使用防卷板的方法更适合用于成年果蝇头部MALDI-MSI切片的制备，并且我们在以下实验中使用了该方法。

2.2通过 DPP 衍生化方法可视化分析成年果蝇头部和脑部的GABA

研究者通常认为，使用MALDI-MSI 很难对果蝇头部的GABA进行分析，这是因为样本中的GABA量少、支持解吸/电离的基质所产生的峰造成干扰以及GABA电离效率低。为解决这些问题，我们尝试使用GABA 的标准溶液建立一种针对通过DPP衍生化的GABA (DPP-GABA)的MALDI-MSI分析方法，进一步通过组织衍生化提高电离效率。将配制好的DPP溶液喷涂在果蝇头部的切片上并在室温下进行60分钟衍生化反应，然后涂敷基质并尝试可视化分析DPP-GABA。然而，与小鼠研究不同的是，在果蝇身上无法获得足够的离子强度。研究者认为造成这一问题的原因之一是成年果蝇大脑中脂质含量高，从而可能对衍生化反应或电离效率产生影响。换句话说，需要进一步优化才能检测果蝇大脑中的微量GABA。

因此，修改了衍生化反应的条件。在填充50%甲醇蒸汽的腔室中进行衍生化来促进其反应，并在衍生化后的样品上喷涂10%乙酸进行组织酸化，从而保持衍生化的GABA正电离的状态。

进行这些措施后，可以清楚地识别出m/z 232.11的峰，即DPP-GABA 衍生的峰（图6A）。并且通过MALDI-MSI分析可以成功地可视化分析DPP-GABA 衍生物的峰在成年果蝇脑部（图6B）和头部（图6C）的局部分布。图6中的结果显示，DPP-GABA衍生的信号分布在整个果蝇大脑中。

已知果蝇中的GABA由谷氨酸脱羧酶(GAD)产生，而GAD分布在整个大脑中。对整个头部进行分析发现，GAD也存在于大脑和大脑周围的局部组织中。为了满足果蝇大脑对能量和氧气的较高需求，大脑由血管和气管系统进行能量和氧气供应(11)。以前对果蝇幼虫的研究中显示，GABA被分泌到循环血淋巴中(12)，由于这种现象也发生在成年果蝇中，因此推测GABA 可能也分布在成年果蝇的整个大脑中。

2.3通过CA衍生化方法可视化分析成年果蝇头部和脑部的GABA

如前所述，通过DPP衍生化方法可以实现GABA衍生信号的可视化分析。然而，由于存在GABA的同分异构体（例如2-氨基丁酸、2-氨基异丁酸和3-氨基丁酸），该方法本身并不支持其同分异构体的可视化分布。由于使用DPP衍生化方法时通过MS/MS分析检测到的m/z 232.11峰是DPP 产生的碎片离子（图6A），因此无法通过MS/MS区分GABA的同分异构体。然而，根据 Maier等人的报告，如果将CA用作衍生化试剂，则可以区分GABA与其同分异构体(9)。

根据参考文献9，将m/z 264.12选作前体离子，在MS/MS分析中检测到产物离子m/z 161、178、191 和 209离子。其中，m/z 191 和 209 为特异性峰，可区分 GABA 的同分异构体。

因此，使用 DPP 衍生化方法获得的结果，在此实验中通过 CA 衍生化结果得到了验证。图7显示了通过CA-GABA分析获得的产物离子质谱图，以及m/z 264.12>191.07 在成年果蝇大脑和头部的分布。与DPP衍生化分析一样，在CA衍生化分析中，GABA也分布于整个大脑和头部（图7A、B）。

在果蝇大脑切片中获得的m/z 264.12的产物离子也得到验证。结果显示，来自2-氨基丁酸和2-氨基异丁酸的m/z 218.2离子，以及来自3-氨基丁酸的m/z 190.09离子，两者完全未被检测到。可以推测，成年果蝇大脑中不存在2-氨基丁酸、2-氨基异丁酸和3-氨基丁酸，或者它们存在的量极小，低于iMScope TRIO的检测限。

基于 DPP-TFB 和 CA 分布的相似性，以及成年果蝇大脑中未检测到 2-氨基丁酸、2-氨基异丁酸和 3-氨基丁酸，这一结果可以认为，本实验成功地对果蝇大脑中 GABA 分布进行了具体可视化分析。这些结果证实，组织衍生化方法对 MALDI-MSI 可视化分析果蝇头部 GABA 是必不可少的。

3.组织衍生化方法的当前状态和独特性

衍生化是GC、LC、GC-MS和 LC-MS普遍采用的一种方法。在分析方法中使用衍生化的目的是通过引入官能团改变待测物质的极性或挥发性，或通过引入能发出荧光的官能团增强分辨率或检测灵敏度。在MSI中，样本表面被直接电离，形成的离子未经过色谱法等化学分离即被进行检测。然而，MSI过程存在一个问题，易被电离分子的离子化会抑制目标分子的电离，因此，可检测分子样本的范围大大缩小。即使在今天，很多使用MSI的研究将重点仍然放在磷脂检测，其中一个原因就是由于在组织表面存在大量磷脂，而它们的分子中含有一个带固定电荷的极性基团，从而实现高灵敏度检测。另一方面，由于上述电离抑制效应，对某些类型的物质来说，不经衍生而直接从组织中检测分子有时非常困难。除了本文中研究的神经递质之外，这些物质还包括氨基酸和类固醇激素，它们都是中极性物质。最近报告了各种解决此问题的组织衍生化方法。表 1 总结了几种代表性衍生化试剂。

首先，除了本报告中讨论的 DPP 和 CA 之外，TAHS 也可以作为氨基基团的衍生化试剂 (13), (14)。由于三甲胺在其分子结构中具有固定的正电荷，TAHS 可以增强电离作用。如参考文献 14 所描述，在 55 ℃ 的条件下进行过夜孵育衍生，然后喷涂 2,5-二羟基苯甲酸并进行 MALDI-MSI 分析(14)。

也可以对氨基基团以外的官能团进行衍生。Girard 试剂 T (GirT) 是一种代表性试剂，它被用于类固醇激素的 MSI 分析 (15)。

GirT在C3位点时对羰基具有高反应性，即使在类固醇激素中也如此，它也能有效用于睾酮和皮质酮的MSI   分析(16)-(18)。在使用GirT的MS/MS分析中，主要检测到丢失三甲胺的[M-59]+离子，可通过对该峰进行进一步碎裂（即MS/MS/MS分析）来分离同分异构体（图8）(18)。关于其他官能团的衍生，一种对酚羟基进行衍生化的试剂被报道。

虽然目前很多详细信息不明，也没有发表任何与此试剂相关的论文，但据报告，该试剂表现出极高的反应活性，反应在试剂被喷涂在组织表面后立即完成。

4.结论

我们的团队首次建立了使用MALDI-MSI可视化分析成年黑腹果蝇头部GABA的方法。使用4% CMC 包埋成年果蝇的头部切片，然后使用液氮快速冷冻这些样本。我们还使用防卷板成功制备了成年果蝇头部切片，并保留了其完好的形态。虽然GABA的离子化比较困难，但我们通过利用GABA的原位组织衍生化来提高其离子化效率，成功实现成年果蝇头部GABA的可视化分析，从而证实了GABA在整个果蝇头部的空间分布。未来有望利用此方法可视化分析作为神经退行性疾病研究模型生物果蝇大脑中的GABA水平。

本论文还对目前使用的组织衍生化试剂进行了总结。随着这些新的样品前处理方法的出现，以前无法实现的生物分子的分布现在也可进行可视化分析。在MSI领域，目前正在积极开发基质和新的衍生化试剂。未来，我们还将开发可应用于多种领域的新样本前处理方法。

参考资料

文献题目

《质谱成像技术应用于成年果蝇大脑中 GABA的可视化分析》

使用仪器

岛津iMScope TRIO

作者

Yosuke Enomoto *1、Masamitsu Yamaguchi *2、Eiichiro Fukusaki *1、Shuichi Shimma *1¡

*1: 大阪大学工程研究生院生物技术系

*2: 京都工艺纤维大学应用生物系

¡：通信作者