益生菌及酸奶制品中微生物快速鉴定
发布时间:2025-08-06 阅读次数：730次
益生菌（如乳杆菌、双歧杆菌和链球菌等）作为有益健康的活菌，其产品质量备受关注。益生菌的主要功效是维护肠道健康，调节肠道菌群平衡等。近期多国研究揭示，市售益生菌产品（包括酸奶）普遍存在益生菌数量不足、菌种不符等问题，影响消费者的信任与厂商信誉。新加坡理工大学（SIT）携手岛津新加坡应用专家合作开发出能够快速、精准检测益生菌的方案，为益生菌及酸奶产品的微生物含量与种类提供MALDI-TOF快速鉴定方法。本研究中使用的所有益生菌产品都是从新加坡各地的超市购买。
MALDI-TOF MS技术通过分析微生物独特的特征性蛋白指纹图谱实现鉴定。每种微生物在质谱仪中都会产生其特有的蛋白峰谱。只需将检测图谱与已知物种数据库进行比对，即可实现微生物的快速、准确识别。凭借其操作简便、速度快的优势，MALDI-TOF MS已成为常规质量控制中替代传统PCR细菌鉴定方法的优选方案。
实验方法
（一）乳杆菌标准品的培养
选取了四种乳杆菌标准品（嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌）进行培养。购自 Creative Enzymes（美国），均为冻干粉形式。所有四种乳杆菌标准品均通过涂布平板法和平板划线法进行培养。
图1a.从左至右：嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌——涂布平板法培养结果
图1b.从左至右：嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌——平板划线培养结果
（二）挑取菌落的样品制备
MALDI-TOF 实验中采用三种方法制备菌落样本：
1、直接法制备流程：
1) 用无菌接种针从平板划线培养物中挑取单菌落；
2) 将菌落直接涂布于洁净的 Fleximass-SR48 钢质 MALDI 靶板样品孔中央；
3) 移取 1 μL 40 mg/mL CHCA 溶液（α-氰基-4-羟基肉桂酸基质）覆盖样本；
4) 室温风干。
2、靶上提取法制备流程
1) 用无菌接种针从平板划线培养物中挑取单菌落，涂布于 Fleximass-SR48 靶板样品孔中央；
2) 移取 1 μL 乙腈配制的 70% 甲酸溶液覆盖样本，室温风干；
3) 移取 1 μL 40 mg/mL CHCA 溶液覆盖样本；
4) 室温风干。
3、全提取法制备流程：
1) 用接种环从平板划线培养物中取一环菌体，转移至无菌 1.5 mL 离心管；
2) 加入 300 μL 纯水，涡旋振荡重悬菌体；
3) 加入 900 μL 无水乙醇，涡旋振荡 1 分钟；
4) 分装悬液至新离心管，10,000 rpm 离心 1 分钟；
5) 弃上清，吸尽残留液体；
6) 二次离心后彻底吸弃上清，菌体沉淀室温风干 10 分钟；
7) 加入 20 μL 70% 甲酸，涡旋至沉淀完全重悬；
8) 加入 20 μL 乙腈，混匀；
9) 10,000g 离心 2 分钟；
10) 取 1 μL 上清液点样于 Fleximass-SR48 靶板，风干；
11) 覆盖 1 μL 40 mg/mL CHCA 溶液，室温风干。
（三）数据采集
由岛津AXIMA Performance（MALDI-TOF/TOF）质谱仪进行数据采集。校准品与样品均采用每个谱图累积10次激光激发，最终谱图由1000个谱图的平均值生成。调节激光功率，以最大限度地提高峰值分辨率和信噪比。
图2a. 采用全提取法获取的嗜酸乳杆菌与干酪乳杆菌MALDI质谱图
图2b. 采用全提取法获取的副干酪乳杆菌与鼠李糖乳杆菌MALDI质谱图
表1. 基于微生物数据库（BioExplorer，北京毅新博创生物科技有限公司）对四种乳杆菌标准品的鉴定成功率统计
表2. 益生菌产品微生物鉴定结果与标签标注菌种的比对
表3. 益生菌/酸奶样品微生物鉴定结果及可信度评分（BioExplorer评分＞25）
结论
本研究证实了MALDI-TOF质谱技术在益生菌及酸奶产品快速真伪鉴别微生物的应用潜力。经系统验证，采用全细胞提取法制备菌落样本可获得更优质谱图谱，从而提升鉴定置信度（BioExplorer）。
岛津台式机MALDI EasyCare系列，荣获My Green Lab颁发的ACT环保标签认证，践行我们对可持续发展和环保责任的承诺。EasyCare功能可轻松进行自我维护，增加实验室正常运行时间，提高分析效率。其体积小巧，能安装于各种实验室。尤其适合有大量样本分析需求的实验室，如微生物鉴定、成像分析、生物制药QC等领域。
参考资料：
会议海报题目《Microbial Identification for Probiotics and Yogurts using
MALDI-TOF Technology》
作者 Tianhua Wang1; Isaac Teh Zhi Xuan2; Chao Sheng Hao2; Naatasha Isahak3
1 Singapore Institute of Technology; 2 Singapore Polytechnic; 3Shimadzu Asia Pacific, Singapore;
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